Cas12a2는 RNA를 통해 유산 감염을 유도합니다

Nov 06, 2023

Nature 613권, 588~594페이지(2023)이 기사 인용

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세균 유산 감염 시스템은 침입자가 복제되기 전에 감염된 세포를 차단하거나 죽임으로써 외부 침입자의 확산을 제한합니다1,2. 여러 RNA 표적화 CRISPR-Cas 시스템(즉, 유형 III 및 VI)은 무차별적인 뉴클레아제3,4,5를 활성화하여 유산 감염 표현형을 유발합니다. 그러나 RNA 유도 단일 효과기 뉴클레아제의 무차별적인 DNase 활성을 활용하는 CRISPR 매개 유산 메커니즘은 아직 관찰되지 않았습니다. 여기에서 우리는 V형 단일 이펙터 뉴클레아제 Cas12a2에 의한 RNA 표적화가 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 비특이적 절단을 통해 유산 감염을 유도한다는 것을 보고합니다. 활성화된 프로토스페이서 측면 서열로 RNA 표적을 인식한 후 Cas12a2는 단일 가닥 RNA(ssRNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA) 및 dsDNA를 효율적으로 분해합니다. 세포 내에서 Cas12a2의 활성화는 SOS DNA 손상 반응을 유도하고 성장을 저해하여 침입자의 확산을 방지합니다. 마지막으로, 우리는 직접적인 RNA 검출을 위해 Cas12a2의 부수적인 활동을 활용하여 Cas12a2가 RNA 유도 RNA 표적화 도구로 용도 변경될 수 있음을 입증했습니다. 이러한 발견은 CRISPR-Cas 시스템의 알려진 방어 능력을 확장하고 CRISPR 기술에 대한 추가적인 기회를 창출합니다.

생명의 모든 영역은 감염원의 확산을 제한하기 위해 세포가 휴면 상태에 들어가거나 죽게 만드는 방어 전략을 사용합니다1. 박테리아와 고세균에서는 이 전략을 유산 감염이라고 하며, 다양한 박테리아 방어 시스템에서 사용됩니다1,2. 최근에는 RNA를 표적으로 하는 CRISPR RNA(crRNA) 유도 적응 면역 시스템이 유산 감염 표현형3,4,5,6을 유발하는 것으로 나타났습니다. VI형 시스템은 RNA를 비특이적으로 분해하므로 Cas13 단일 효과기 뉴클레아제는 crRNA 유도 효과기와 무차별 RNase3,7,8 역할을 모두 수행합니다. 유형 III 시스템에서 표적 RNA 결합은 순환형 올리고아데닐레이트 2차 전달자의 생성을 유발하여 결국 무차별적인 보조 RNase 및 ssDNase를 활성화하여 유산 감염을 유도할 수 있습니다. 더욱이, 유산 감염은 유형 III 이차 메신저를 통해 활성화된 무차별 dsDNase(예: NucC)에 의해 매개되거나 유형 V Cas12a 단일 효과기 뉴클레아제14의 무차별 ssDNase 활성에 의해 매개되는 것으로 제안되었습니다. 그러나 유형 III CRISPR 매개 dsDNase 활성은 아직 생체 내에서 검사되지 않았으며 Cas12a의 ssDNase 활성은 최근 유산 감염을 유발하지 않는 것으로 나타났습니다15.

여기에서 우리는 V형 단일 효과기 CRISPR 관련(Cas) 뉴클레아제인 Cas12a2가 crRNA 가이드에 상보적인 플라스미드로 공격을 받을 때 유산 감염 표현형을 유도한다는 것을 보고합니다. 재조합 단백질을 사용한 생화학적 분석에서는 Cas12a2가 RNA 표적을 인식하여 다른 단일 하위 단위 RNA 표적화(예: Cas13a) 및 dsDNA 표적화(예: Cas12a)와는 다른 비특이적 dsDNA-, ssDNA- 및 ssRNA-뉴클레아제 활성을 발현하는 것으로 나타났습니다. ) Cas 뉴클레아제8,16,17. 또한, 우리는 Cas12a2 비특이적 뉴클레아제 활성이 박테리아 DNA를 손상시켜 SOS 반응을 유발하고 세포 성장을 손상시킨다는 것을 보여줍니다. 종합적으로 이러한 결과는 Cas12a2의 dsDNase 활성이 유산 감염 표현형을 유발하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 원리 증명 시연으로 우리는 Cas12a2가 다양한 온도에서 RNA 표적화 Cas13a 뉴클레아제와 비슷한 감도로 RNA를 감지할 수 있음을 보여줍니다.

Cas12a2는 Cas12a16과 관련된 V형 이펙터 뉴클레아제 그룹으로 구성되며, Cas12a2 오솔로그는 이전에 Cas12a 변종으로 분류되었습니다. 우리의 분석은 유사하게 Cas12a 뉴클레아제와 마지막 공통 조상을 공유하는 단일계통 계통군에 배치합니다(그림 1a 및 확장 데이터 그림 1). 추가 분석에 따르면 CRISPR-Cas12a2 및 CRISPR-Cas12a 시스템은 보존된 3' 말단을 갖는 CRISPR 반복을 특징으로 하며 뉴클레아제는 상동성 RuvC 엔도뉴클레아제 도메인과 N 말단에 유사하게 예측된 2차 구조를 가지고 있음이 밝혀졌습니다(그림 1b 및 보충 그림 2). . 보존된 RuvC 유사 도메인과 N 말단에도 불구하고 Cas12a2는 Cas12a 가교 나선 대신에 기능을 알 수 없는 큰 도메인이 존재하고 Cas12a Nuc 도메인 대신 아연 핑거 도메인이 존재한다는 점에서 Cas12a와 구별됩니다. 그림 1b 및 보충 그림 2). 계통발생 분석과 최근의 구조적 결과19를 결합한 원래 분류를 고려하여 우리는 이러한 독특한 V형 뉴클레아제를 Cas12a2로 명명했습니다.